蛋白酶K（Proteinase K）来源于林伯氏白色念球菌，是一种与枯草杆菌蛋白酶相关的丝氨酸蛋白酶，由于能降解角蛋白（Keratin），因此被命名为蛋白酶K。它由一条肽链组成，包含277个氨基酸残基，相对分子质量为28930；具体结构、氨基酸序列及三维空间结构与枯草杆菌蛋白酶极其相似，区别在于蛋白酶K结构中还含有二硫键和两个Ca2+结合位点；得益于二硫键和Ca2+结合位点的存在，蛋白酶K在高温环境和广泛pH条件下仍能保持活性和优异的稳定性。蛋白酶K具有极高的酶活性和广泛的底物特异性，能优先分解与疏水性氨基酸、含硫氨基酸、芳香族氨基酸C末端邻接的酯键和肽键，可将蛋白质降解成短肽。

从林伯氏白色念球菌（tritirachium album limber）中纯化得到。据资料显示：该酶有两个Ca2+结合位点，它们离酶的活性中心有一定距离，与催化机理并无直接关系。然而，如果从该酶中除去Ca2+，由于出现远程的结构变化，催化活性将丧失80%左右，但其剩余活性通常已足以降解在一般情况下污染酸制品的蛋白质。所以，蛋白酶k消化过程中通常加入EDTA（以抑制依赖于Mg2+的核酸酶的作用）。但是，如果要消化对蛋白酶k具有较强耐性的蛋白，如角蛋白一类，则可能需要使用含有1mmol/l Ca2+而不含EDTA的缓冲液。在消化完毕后、纯化核酸前要加入EGTA（ph8.0）至终浓度为2mmol/l,以鳌合Ca2+。

蛋白酶K，是一种切割活性较广的丝氨酸蛋白酶。它切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键。此酶经纯化去除了RNA酶和DNA酶活性。由于蛋白酶K在尿素和SDS中稳定，还具有降解天然蛋白质的能力，因而它应用很广泛，包括制备脉冲电泳的染色体DNA，蛋白质印迹以及去除DNA和RNA制备中的核酸酶。蛋白酶K的一般工作浓度是50—100μg/ml。在较广的pH范围内（pH 4-12.5）均有活性。

推荐反应缓冲液：50mMTris-HCl(pH7.5),10mM CaCl2 。

蛋白酶K配制标准：20mg/ml蛋白酶K配制标准（proteinase K）：将200mg的蛋白酶K加入到9.5ml水中，轻轻摇动，直至蛋白酶K完全溶解。不要涡旋混合。加水定容到10ml，然后分装成小份贮存于-20℃。

蛋白酶K是一种丝氨酸蛋白酶，因此可以用苯甲基磺酰氟抑制其作用，苯甲基磺酰氟是一种丝氨酸蛋白酶的抑制剂。

值得注意的是，蛋白酶K在原位杂交技术中通常用于杂交前的处理,它具有消化包围靶DNA蛋白质的作用,以增加探针与靶核酸结合的机会,提高杂交信号.但蛋白酶K的浓度过高、消化时间过长或孵育温度过高时,都会对细胞的结构有一定的破坏,导致组织切片的脱落,细胞核的消失,从而影响杂交结果.EDTA缓冲液可以替代蛋白酶K的作用,解决上述出现的问题,并能达到理想的染色效果.

保存：保存在－20℃冰箱里，避免反复冻融，有效保证12月。

孵育温度为55至65℃，理想孵育温度为58℃，孵育时间为15分钟至48小时；理想孵育时间为2小时。

蛋白酶K已广泛应用在皮革、毛皮、丝绸、医药、食品、酿造等方面。皮革工业的脱毛和软化已大量利用蛋白酶，既节省时间，又改善劳动卫生条件。蛋白酶还可用于蚕丝脱胶、肉类嫩化、酒类澄清。临床上可作药用，如用胃蛋白酶治疗消化不良，用酸性蛋白酶治疗支气管炎，用弹性蛋白酶治疗脉管炎以及用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶对外科化脓性创口的净化及胸腔间浆膜粘连的治疗。加酶洗衣粉是洗涤剂中的新产品，含碱性蛋白酶，能去除衣物上的血渍和蛋白污物，但使用时注意不要接触皮肤，以免损伤皮肤表面的蛋白质，引起皮疹、湿疹等过敏现象。