南京敌人罪行调查委员会是中国南京市最早成立的敌人罪行及南京大屠杀案的调查机构。调查和惩办第二次世界大战中日本的战争罪行，惩办战犯的诉求，早在战争期间就被提出，国民政府在战争期间已经开展了一些零星调查。

1938年10月15日，国民参政会参政员们在重庆召开的第一届国民参政会第二次大会上提出了“尽快设立抗战公私损失调查委员会”的提案：“抗战已及16个月，公私损失，不可以计数。到战争结束时，一、必须向敌方提出赔偿问题；二、未来之国史，必将此空前惨痛之事迹，翔实记载，昭告天下及后世，凡此皆须有正确之数字为根据。也应该将战时损失调查与统计完整，以正确的数字为根据。”1943年6月，在重庆的国民政府决定筹设敌人罪行调查委员会。抗战胜利后，国民政府重新迁都南京，各项日军罪行调查工作，得到了更为迅速及更大规模的开展。其中，侵华日军南京大屠杀案罪行调查是迁址南京后最重要的工作之一。1945年到1946年，南京市的日军罪行调查和抗战损失调查机构相继成立，如:南京敌人罪行调查委员会、南京抗战损失调查委员会、临时参议会南京大屠杀案敌人罪行调查委员会等，并陆续开展了调查统计工作。南京敌人罪行调查委员会成立后，其主要工作职能是开展日军罪行的调查，主要有调查谋杀、屠杀及有组织、有计划之恐怖行为的罪行；调查强奸妇女或强迫妇女为娼的罪行；调查强迫占领地区民众服兵役的罪行；调查抢劫罪行；调查施行集体惩罚之行为的罪行；调查滥炸不设防城市或非军事目标的罪行等。

该机构到1946年2月，共获得500余份资料。这500余份资料涉及日军在南京的屠杀、伤害、奸淫、劫夺、破坏、强制服役以及中岛、长谷川等29支日军部队罪行总数达295882种。具体调查统计结果分为五个部分：“关于屠杀的调查：在南京沦陷时，雨花台区有军民二三万不及退却，经敌人扫射，哀声震地，尸积如山，血深没胫。八卦洲争相渡江的军民，悉被扫射，尸体蔽江，水为之赤……”；“关于伤害的调查：敌宪兵队任意诬陷人民为中国兵，被捕而去，以绳索或钢丝捆起，悬之空中，不使着地。尤禁止受伤者不得呻吟，倘有一人犯戒，必全体悉被毒打……”；“关于奸淫的调查：一般青年妇女以至六七十岁之高龄老妇，被害者甚多，其方式有强奸者，有轮奸者，有拒奸至死者，有令父奸其女，兄奸其妹，翁奸其媳，以为笑乐者，种种情况，惨不忍睹……”；“关于劫夺的调查：城中商店住户，所有衣物器皿珍宝，任意搜刮，所劫财物，悉被搬运一空……”；“关于其他的调查：敌多摩部队将我被俘虏之同志，引至医药试验室，将各种有毒细菌注射于其体内，观其变化……”。检察官陈光虞在该机构的调查报告中称：“敌人罪行残暴凶悍毒辣，无所不用其极，综计所获材料，被杀害人之确数达30余万……实人类史上空前未有之惨剧。”