线粒体基质（学名：mitochondrial matrix）是由线粒体内膜包裹的内部空间，内含催化三羧酸循环、脂肪酸氧化等生化反应的酶类及多种蛋白质，其中苹果酸脱氢酶为其标志酶。基质中还包含线粒体DNA、RNA及核糖体，可自主进行部分遗传信息表达。该结构参与ATP生成、细胞凋亡调控及胆固醇合成等代谢过程。肝细胞线粒体基质中含有处理氨的特定酶类，相关基因突变可导致多种线粒体疾病。正常状态下，荧光探针JC-1在线粒体基质中形成聚合物并发出红色荧光。

线粒体是真核生物具有的用于有氧呼吸的细胞器。

线粒体基质是线粒体中由线粒体内膜包裹的内部空间，其中含有参与三羧酸循环、脂肪酸氧化、氨基酸降解等生化反应的酶等众多蛋白质，所以较细胞质基质黏稠。苹果酸脱氢酶是线粒体基质的标志酶。线粒体基质中一般还含有线粒体自身的DNA(即线粒体DNA)、RNA和核糖体(即线粒体核糖体)。

线粒体具有内、外两层膜，内膜的某些部位向线粒体的内腔折叠形成嵴，嵴使内膜的表面积大大增加。嵴的周围充满了液态的基质。线粒体的内膜上和基质中含有许多种与有氧呼吸有关的酶。一般的说，线粒体均匀地分布在细胞质中。但是，活细胞中的线粒体往往是可以定向移动到代谢比较旺盛的部位。肌细胞内的肌质体就是由大量变形的线粒体组成的，肌质体显然有利于对肌细胞的能量供应。

除各种酶之外，线粒体基质中还有核糖体和少量DNA分子。也就是说，线粒体含有自己的遗传物质，且具有能够加工其自身DNA和蛋白的工具（参见：蛋白质生物合成）。细胞染色体之外的DNA编码几种线粒体的肽（人有13种），包括线粒体内膜中的蛋白，而更多的蛋白是由细胞核中的基因编码的。

虽然线粒体的首要功能是分解有机物，产生能量（以生成ATP的形式），但线粒体在其他代谢反应里还起到很大的作用。如：

细胞凋亡，谷氨酸受体介导的兴奋毒效应，细胞增殖，细胞氧化还原状态调节，原血红素合成，胆固醇合成，产生热量（使生物保持温暖）。

某些特定的细胞线粒体有特定的功能，例如肝细胞的线粒体含有处理氨的酶，可以处理这种蛋白质代谢后带有毒性的物质。如果某些与线粒体功能有关的基因突变，会导致各种不同的线粒体病。