反相层析是以非极性键合相为固定相、强极性溶剂为流动相的液相层析技术，通过溶质极性差异实现物质分离。其核心表现为极性大的组分先出峰，极性小的组分因与固定相作用强而保留时间延长。该技术通过水相覆盖硅羟基的特殊设计，有效缓解传统吸附层析中低极性物质拖尾现象，适用于肽段、核苷酸、糖类等小分子物质的精密分离。

以化学键合方式将十八烷基（C18）或辛烷基（C8）等非极性基团固定在硅胶载体表面形成固定相。流动相采用水、甲醇、乙腈等强极性溶剂，通过调节其比例改变流动相极性。

采用乙腈-水体系时，流动相pH值通常控制在2.0-8.0范围内以防止硅胶溶解。保留时间与溶质疏水性呈正相关，疏水参数（logP）每增加1个单位，保留时间可延长2-3倍。理论塔板数可达每米20000-50000，显著高于正相层析体系。

流动相需严格脱气以避免气泡影响柱效，操作压力通常维持在10-40MPa范围。对于强疏水性物质（logP>5），可能出现洗脱困难，需加入0.1%三氟乙酸等离子对试剂改善分离。色谱柱使用温度上限为60℃，长期高温运行会加速固定相降解。