分离纯化是通过物理化学手段将多糖混合物转化为单一多糖组分的系统性过程，主要包括脱蛋白、脱色等预处理及核心分离步骤。柱层析法（凝胶过滤层析、离子交换层析）与分级沉淀法（乙醇沉淀、季铵盐沉淀）是该领域的主流技术。工业应用中常采用DEAE-纤维素柱层析分离酸性多糖，配合Sephadex凝胶色谱实现分子量分级，超滤膜技术（100kDa/5kDa）则可高效截留特定分子量多糖。杜仲多糖等案例显示，复合纯化工艺可将多糖纯度提升至89%以上，正交试验设计优化参数是该过程的重要环节。

粗多糖需经过脱脂、脱色及去蛋白预处理。Sevage法（氯仿-正丁醇混合液）可去除91.48%蛋白质，同时保留65.49%多糖，三氟三氯乙烷法对热敏性多糖的保护效果更优。过氧化氢脱色处理能使多糖溶液透光率提升至95%以上，活性炭吸附法适用于深色多糖溶液的脱色。

5kDa超滤膜可截留分子量5kDa以上的多糖组分，真空冷冻干燥技术可保持多糖生物活性，回收率比普通干燥高12.8%。超滤-透析联用工艺使阿里红多糖的杂质去除率提升至97.6%。

在杜仲多糖纯化中，AB-8型大孔树脂使纯度提升至35.8%，配合Sephadex G-200凝胶柱层析后总糖含量达89.12%。云芝多糖采用TSK-GEL G3000PWxl色谱柱，通过0.05mol/L硫酸钠流动相建立分子量标准曲线。金属配位法使用铜氨溶液可沉淀85%以上的葡聚糖类多糖，但残留金属离子需经EDTA处理去除。

纯度验证采用紫外全波长扫描（260nm/280nm无吸收峰），凝胶色谱法要求保留时间差异小于5%。响应面法优化工艺参数可使壳聚糖衍生物得率提高23.8%，超速离心法（12000r/min）可检测微量蛋白质残留。