建安六年（201年），
刘备因为遭到
曹操的攻打，于是前往
荆州（治襄阳，今湖北襄阳）投奔刘表。刘备在荆州期间，伊籍经常拜访刘备，托请刘备照顾。
建安十三年（208年）八月，刘表去世，伊籍于是转而投靠刘备，跟随刘备南渡长江，后来又跟随刘备进入
益州（治成都，今四川成都）。
建安十九年（214年），刘备平定益州，进入成都（今四川成都），自己兼任
益州牧，任命伊籍为
左将军从事中郎，伊籍所受到的待遇仅次于昭德将军
简雍和秉忠将军
孙乾等人。
刘备称帝，建立蜀汉政权后，升任伊籍为昭文将军。伊籍与
诸葛亮、
法正、
刘巴、
李严共同制定《
蜀科》，《蜀科》是治理
蜀汉所用的法律，《蜀科》中的条列律令都出自这五人之手。
有一次，刘备派遣伊籍出使
东吴，吴主
孙权听说伊籍很有辩才，想用言辞挫败他。伊籍刚进殿入拜行礼，孙权对他说：“你侍奉无道之君很辛苦吧。”伊籍当即回答：“一拜一起，谈不上什么辛苦。”伊籍的随机应变之敏捷，大都与此类似，孙权对他的回答十分惊异。
而后辅佐
关羽，于关羽讨魏时，与马良共为参谋，一同征进。后荆州失守，
关羽遣马良、伊籍、赍文三道，星夜赴成都求救。
1994年电视剧《
三国演义》分别由刘龙滨（《赤壁鏖战》）、王辉 （《三足鼎立》）饰演伊籍